Chromatographie sur couche mince

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La chromatographie sur couche mince (abrégée CCM, en anglais TLC pour Thin Layer Chromatography) est une technique expérimentale de séparation des composés organiques basée sur leur différence de polarité, et sur leur affinité plus ou moins prononcée pour le support sur lequel ces composés sont déposés et le solvant qui parcourt le support. Elle est mise à profit en analyse pour l'identification sommaire de composés dans un mélange en utilisant des références de chacun des corps purs supposés être contenus dans ce mélange, ou encore le contrôle de l'avancée d'une réaction chimique, ou enfin la vérification de l'efficacité d'une purification ou d'une extraction.

Plaque de chromatographie sur gel de silice avec révélateur UV 254.

Les méthodes chromatographiques ont été découvertes par le botaniste russe Mickaël Tswett en 1826 lorsqu'il fit une chromatographie de pigments végétaux sur du carbonate de calcium et en utilisant de l'éther de pétrole comme éluant.

Sommaire

1 En théorie

La chromatographie est une technique basée sur l'affinité des composés extraits pour la phase fixe et la phase mobile, c'est ce que l'on va détailler ici.

Pour parvenir à la séparation, on effectue la chromatographie sur une plaque de gel de silice (la silice est un "sable" spécial composé de SiO2) qui constitue la phase fixe sur laquelle vont se déplacer les composés à séparer. On peut également utiliser en lieu et place de la silice des plaques de cellulose ou du papier Whatman pour chromatographie. On choisira en fonction des composés à séparer et des éventuelles méthodes de révélations voulues.

Pour aider les composés à se déplacer, on fait migrer par capillarité un solvant, appelé alors "éluant", qui constitue ainsi la phase mobile.

Une petite quantité du mélange à analyser est déposée sur un support (phase fixe), et est entraînée par l'éluant (phase mobile).

Selon leur affinité, les substances sont plus ou moins retenues par la phase fixe, ce qui rend leur séparation possible. On appelle ce processus "élution".

En théorie, une substance déposée sur un support et entraînée par un certain éluant, se déplacera exactement à la même vitesse que la même substance déposée sur un autre support exactement identique et entraînée par le même éluant. Ceci permet de comparer une substance contenue dans un mélange (par exemple, un milieu réactionnel) avec une substance pure (par exemple, le réactif limitant de la réaction).

2 Choix de l'éluant

L'éluant doit être chimiquement inerte avec le mélange à séparer. Cela ne pose généralement pas de problème avec les solvants usuels.

Pour trouver le bon éluant, ou mélange d'éluants, on effectue des tests préliminaires.

2.1 Technique microcirculaire

Pour gagner du temps et ne pas gaspiller des plaques de chromatographie, on utilisera souvent la "technique microcirculaire".

Cela consiste à spoter la solution de l'échantillon sur une plaque CCM et, à l'aide d'un capillaire, ajouter lentement le solvant testé.

L'échantillon est élué et, lorsque la plaque est révélée (bien sûr, on fera plusieurs tests avant de révéler la plaque), on peut constater une bonne ou mauvaise séparation par rapport au solvant utilisé.

Une bonne séparation donnera des cercles distincts et les plus fins possible.

Si l'on n'obtient pas de bons résultats avec un solvant pur, on pourra également essayer avec des mélanges de solvants. On utilise comme éluants des mélanges de deux solvants ou plus, de polarité différente.

2.2 Technique basée sur les rapports frontaux et la force d'élution

Voir la page concernant cette méthode : Optimisation de mélange d'éluants pour CCM

3 Cuve de développement

La cuve de développement est un récipient en verre muni d'un couvercle. Un pot de confiture fait l'affaire.

L'éluant est versé dans la cuve sur une hauteur ne dépassant pas 1cm, afin que l'endroit où la substance a été appliquée ne soit pas plongé dans l'éluant.

La cuve est alors fermée, et on attend une demi-heure pour que le système soit saturé en vapeurs de solvant. Si on ne veut pas attendre, on peut ajouter un papier filtre qui sera plaqué contre la paroi et plongé dans l'éluant. L'éluant montant par capillarité, la surface d'évaporation augmente radicalement et la cuve est rapidement saturée. Ceci afin d'éviter une évaporation directement sur la plaque de chromatographie, ce qui provoquerait une perturbation du flux de l'éluant dans les bords de la plaque. La distance parcourue par les substances serait alors plus grande au bord qu'au milieu.

4 En pratique

Les supports les plus utilisés sont des plaques recouvertes de silice, et dans une moindre mesure celles recouvertes de cellulose.

Au crayon papier, on trace deux lignes perpendiculaires à la longueur de la plaque, à environ 1,5 cm de chaque extrémité. Il faut faire attention à ne pas endommager la silice.

L'une de ces lignes, celle du bas, sera le "start". C'est sur cette ligne qu'on déposera le mélange et les références.

Pour ce faire, on dissout en général les échantillons dans un solvant de façon à obtenir une concentration de 0,1 à 5%. Ce solvant doit être chimiquement inerte, pur, et le plus volatil possible.

Les solutions obtenues sont déposées sur le start à l'aide de capillaires, ou simplement avec une pipette pasteur (cela demande un peu plus d'entraînement). Les dépôts d'échantillons (spots) doivent être aussi petits que possible. Leur position devra être soigneusement marquée au crayon.

La ligne du haut est le "front d'élution". Lorsque l'éluant aura atteint cette ligne, il faudra stopper la CCM et sécher la plaque. Ainsi, on pourra comparer la distance parcourue par la substance sur la distance parcourue par l'éluant, et obtenir une valeur appelée "Rf" (Retention factor). Le Rf n'est pas une valeur propre à chaque substance ! Cette valeur permet juste de comparer rapidement deux substances éluées sur la même plaque.

5 La révélation

La révélation est l'étape qui permet de visualiser de manière aisée la position des taches (issues du déplacement des constituants des mélanges déposés sur la plaque) obtenues en fin d'élution et après séchage de la plaque.

Toutes les substances n'étant pas colorées, ou faiblement colorées, les taches peuvent être invisibles sur la plaque. Parmi les méthodes de révélation des plaques, on utilise la révélation aux UV et l'utilisation de réactifs chimiques.

5.1 Révélation aux UV

Les plaques de chromatographie sur couche mince actuellement sont vendues avec des indicateurs, déjà déposés à la surface de la plaque, qui permettent une révélation aux ultraviolets (UV) (254 ou 366 nm), c'est le plus souvent du silicate de zinc activé au manganèse [1]

Les UV 254 provoquent en effet une fluorescence vert clair lumineux de cet indicateur. Ainsi, les substances absorbant les UV empêcheront ces derniers d'atteindre la plaque et l'indicateur. On visualisera alors le spot comme un endroit ne présentant aucune fluorescence (le spot apparaîtra en violet).

Pour les substances fluorescentes, on utilisera généralement les UV 366. Les spots apparaîtront fluorescents, contrairement à la plaque qui restera violette.

5.2 Révélation avec des réactifs

On utilise divers réactifs qui vont former des taches colorées avec les substances déposées sur la plaque. L'avantage est qu'il existe des réactifs spécifiques de certaines fonctions organiques, ou familles de substances.

Par exemple, pour des substances à liaisons aliphatiques insaturées, on peut exposer la plaque CCM à des vapeurs d'iode SGH07SGH09. Les substances apparaîtront alors sous forme de taches brunes.

Pour une liste très complète de réactifs, consulter le document (en anglais) Dyeing Reagents for Thin-Layer and Paper Chromatography (téléchargement depuis le site du CCCM).

6 Voir aussi

7 Références

  1. http://en.wikipedia.org/wiki/Thin_layer_chromatography
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